荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素（luciferin）氧化，在氧化的过程发出生物荧光，此时可通过荧光测定仪设备测定释放的生物荧光。
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，我们可以把感兴趣的基因转录调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。正是由于这样的发光特性，使得海肾荧光素酶可以用作双荧光素酶报告基因实验中的内参。
萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶发光原理
单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。其次双荧光素酶报告基因检测系统中的荧光素酶可以在哺乳细胞中直接表达，无需表达后修饰，直接具备完全酶活性。与绿色荧光蛋白（GFP）不同，它们的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强，这使其具备可定量、高灵敏度及低背景等特点。
在实验中，通常以海肾荧光素酶基因作为内参，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。
计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比海肾荧光素酶检测值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
1.基因表达调控研究：
通过将报告基因与目标基因的启动子或调控序列连接，可以观察不同条件下这些序列对基因表达的影响。主要包括：启动子活性分析、增强子/沉默子功能研究、miRNA对靶mRNA/LncRNA的调控等；
检测miRNA对靶mRNA的调控：
2.信号通路研究：
通过将报告基因与信号通路相关的调控元件连接，可以检测信号通路在不同条件下的活性变化。主要包括：信号通路激活检测、信号通路抑制剂筛选等；
3.转录因子活性检测：
通过将报告基因与转录因子结合位点连接，可以观察转录因子在不同条件下对基因表达的调控作用。主要包括：转录因子功能研究、转录因子突变分析等；
检测转录因子的作用：
4.基因突变功能研究：
通过比较野生型和突变型基因的报告基因活性，可以评估突变对基因功能的影响。主要包括：突变筛选、功能恢复实验等；
5.基因沉默效应评估：
在RNA干扰（RNAi）或CRISPR/Cas9基因编辑技术中，双荧光素酶报告系统可以用于评估基因沉默或基因敲除的效果。通过检测报告基因的活性变化，可以判断基因沉默或敲除的效率。主要包括：RNAi效果评估、CRISPR/Cas9敲除效率检测等；
6.细胞毒性和细胞活力检测：
该系统还可以用于评估细胞毒性和细胞活力。通过检测荧光素酶的活性，可以间接评估细胞的健康状态和存活率。主要包括：细胞毒性评估、细胞活力检测等；
本次分享以pisCHECK2质粒为例做后续阐述。以has-mir-146a-5p对靶基因的影响为例。
pisCHECK-2质粒图谱：
1.预测靶位点：
预测hsa-mir-146a-5p的靶位点
2.实验方案
NPHP4编码一种参与肾小管发育和功能的蛋白质。这种蛋白质与肾囊蛋白相互作用，属于一种多功能复合物，定位于基于肌动蛋白和微管的结构。该基因的突变与4型肾病（一种肾脏疾病）和4型Senior-Loken综合征（肾病和视网膜色素变性的组合）有关。
以NPHP4为实验靶基因，构建pisCHECK2-NPHP4 3’UTR-WT载体和pisCHECK2-NPHP4 3’UTR-mut载体，提取无内毒素质粒，转染293T细胞，待转染效率达到80%后，裂解细胞，检测双荧光素酶活性；
pisCHECK-- NPHP4 3’UTR质粒图谱：
3.实验结果
3.hsa-mir-146a-5p与3’UTR相互作用的分析
本次奥创生物细胞分子实验室开展的micRNA对目的基因影响的双荧光素酶实验，从荧光酶标仪测定的相关数据中得出结论：在转染了mimic- mir-146a-5p后，NPHP4的相对表达量可能受到影响，而未转染mimic- mir-146a-5p或不含NPHP4基因的实验组作为对照辅助验证该结论，需要继续补充PCR以及WB实验做进一步验证。 若有相关检测需求，请联系我们。
