常见脾脏造模有:保留脾脏功能手术模型、门脉高压症模型、脾虚模型和脾切除模型等。下面详细讲解脾切除造模实验:通过观察脾脏切除对小鼠胰岛形态功能及肠道微生物的影响,探讨脾脏与肠道微生物及胰岛功能之间的内在联系。
1、脾切除组小鼠参考Yin等的改良方法进行完全脾切除手术,麻醉,腹部剃毛、消毒,沿左侧腹中线肋下1 cm横行切口进入腹腔,游离脾脏,结扎脾动脉及静脉,切除全部脾脏。
2、切脾 120天后脱颈椎法处死小鼠,Y字解剖法打开小鼠腹腔,迅速取出胰腺、肝、小肠组织。空腹血糖浓度测定,切脾后第 120天进行口服糖耐量试验(OGTT),并进行统计学分析。新鲜肝组织将用于Western Blot实验检测TLR-4、TGF-β1蛋白含量;新鲜胰腺、小肠组织用于制作病理切片HE染色。
3、实验结果可知脾切除组血糖平均值显著高于正常对照组及假手术组;脾切除组2h内血糖AUC相比正常对照组和假手术组显著增加;脾切除组小鼠血清胰岛素水平为较正常对照组及假手术组显著升高;脾切除组血清C肽水平显著高于正常对照组及假手术组。胰腺组织HE染色结果显示:脾切除组小鼠胰岛数目减少,胰岛内细胞减少,个别胰岛内可见大量浆细胞、淋巴细胞及中性粒细胞浸润,周围散在少量核尘。假手术组和正常对照组小鼠胰腺组织大致正常;小肠组织HE染色结果显示:脾切除组小鼠肠黏膜稍粗糙,黏膜内可见散在的淋巴细胞,浆细胞浸润,黏膜下大量淋巴组织增生。假手术组小鼠和正常对照组小鼠肠黏膜均有不用的淋巴细胞。脾切除组小鼠肝脏中的 TGF-β1 蛋白含量显著高正常对照组及假手术组,而脾切除组肝脏中TLR-4表达显著低于正常对照组及假手术组。
4、全脾切除干预会引发肠道微生态紊乱,机体免疫功能失常,小鼠,胰岛分泌功能紊乱,产生胰岛素抵抗,病原体清除和抗原递呈功能障碍,呈现慢性炎症,淋巴细胞数量减少,肝脏 TLR-4 显著降低,TGF-β1 显著升高,不仅免疫功能受损,糖代谢也失去了平衡,能量稳态被打破,远期有发生2型糖尿病、肿瘤等疾病风险。
扫描 ( 仪器名称:数字切片扫描仪、正置光学显微镜、荧光生物显微镜 )
白光显微镜拍照 (品牌型号:3D-HISTECH、Leica、广州市明美光电技术有限公司)
荧光显微镜拍照 (品牌型号:Pannoramic MIDI II、DM500、MF23-M)
1、Masson:采用数字切片扫描仪/显微镜进行图像采集。每张切片先于低倍下观察全部组织,再分别选取3个视野采集200/400倍纤维图像。采用Image-ProPlus图像分析系统测定所采集全部图像面积和胶原阳性面积,并计算每张图像的CVF值;每列样本的平均CVF值为3张图像的平均值。
2、IHC和IF:采用数字切片扫描仪/显微镜进行图像采集。每张切片优于低倍下观察全部组织,再分别选取3个视野采集200/400倍显微图像。采用Image-ProPlus图像分析系统测定所采集全部图像积分光密度(IOD)表示;每例样本的积分光密度为3张图像的平均值。